Análise Técnico-Econômica para a produção de biofármacos de L-asparaginase / Technical-Economic analysis for the production of L-asparaginase biopharmaceuticals

A enzima L-asparaginase é comumente utilizada como biofármaco para o tratamento da Leucemia Linfoblástica Aguda e possui altas taxas de cura com o medicamento disponível no mercado. Atualmente a aquisição deste biofármaco é fruto integral de importação, não sendo realizada produção nacional, muito embora existam grupos de pesquisas nacionais que trabalham em pesquisas e no desenvolvimento de biofármacos alternativos da L-asparaginase. Assim, a presente dissertação tem como objetivo realizar análises técnico-econômicas para avaliar a viabilidade de implementação industrial de bioprocessos para a produção da L-asparaginase do tipo Erwinase PEGuilada e não PEGuilada, que foram previamente desenvolvidos na FCF-USP. As análises técnico-econômicas foram conduzidas por meio do software SuperPro Design® (Intelligen, Inc.) e permitiram adaptar o processo laboratorial para um processo piloto e possibilitaram estimar os valores de custo de produção unitário (Unity Cost of Production - UPC) de US$ 12,37/mg e US$ 3,46/mg para a L-asparaginase monoPEGuilada e nativa obtida por processo similar, respectivamente. O custo unitário de produção para a enzima peguilada foi, portanto, estimado em cerca de 4 vezes o mesmo custo para a produção da enzima peguilada, sendo tal aumento de custo devido às operações de peguilação, já que ambas as plantas foram mantidas nas mesmas dimensões. Ainda, foram obtidos indicadores econômicos, que indicam a atratividade do processo desenvolvido, muito embora tenham sido identificados diversos gargalos de processo e fatores a serem otimizados e melhorados de forma a tornar o processo mais atrativo sob os pontos de vista técnico e econômico. Em uma análise de sensibilidade preliminar um aumento factível da densidade celular já mostra que é possível reduzir em mais de 30% o UPC. De toda forma, ainda que não otimizado, o processo apresentou valores e dados compatíveis com os biofármacos de L-asparaginase já disponíveis no mercado

The enzyme L-asparaginase is commonly used as a biopharmaceutical in the treatment of Acute Lymphoblastic Leukemia, presenting high cure rates with the formulations available on the market. Nowadays, the acquisition of this biopharmaceutical is only from importation, given that there is no national production being carried out, although there are national research groups working on research and development of alternative L-asparaginase biopharmaceuticals. Thus, this project aims at carrying out technical-economic analyzes to evaluate the viability of industrial implementation of bioprocesses for the production of L-asparaginase of the PEGylated and non-PEGylated Erwinase type previously developed at FCF-USP. The technical-economic analyzes, conducted by means of the software SuperPro Design® (Intelligen, Inc.), allowed to adapt the laboratory process to a pilot process and made it possible to estimate the unit cost of production (UPC) values of US $ 12.37 / mg and US $ 3.56 / mg for monoPEGylated L-asparaginase and bare obtained by similar process, respectively. The unit cost of production for the pegylated enzyme was, therefore, estimated at about 4 times the same cost for the production of the pegylated enzyme, such an increase in cost due to pegylation operations, since both plants were maintained in the same dimensions. Moreover, economic indicators were obtained, which indicate the attractiveness of the developed process. However, several process bottlenecks and factors to be optimized and improved were identified to make the process more attractive from the technical and economic point of view. In a preliminary sensitivity analysis, a feasible increase in cell density already shows that it is possible to reduce UPC by more than 30%. Accordingly, although not optimized, the process presented values and data compatible with the L-asparaginase biopharmaceuticals already available on the market

Produção de biossurfactantes: manoproteínas intracelulares e soforolipídios extracelulares por Saccharomyces cerevisiae / Biosurfactant production: intracellular manoproteins and extracellular sophorolipids by Saccharomyces cerevisiae

RESUMO Os biossurfactantes apresentam inúmeras aplicações ambientais e são produzidos por diversos microrganismos. Os provenientes da levedura Saccharomyces cerevisiae são pouco estudados para fins ambientais, sendo atóxicos. Objetivou-se o estudo da produção de biossurfactantes intra e extracelular por essa levedura, desenvolvida em meio de cultivo contendo 0,5% de extrato de levedura e 1% de peptona, além de concentrações variadas de sacarose e indutores oleosos - glicerol e óleos de soja e diesel. Os experimentos foram realizados durante 96 horas, e a produção de biossurfactantes foi avaliada diariamente, por meio da redução da tensão superficial e de estabilização de emulsões. O biossurfactante extracelular foi extraído da biomassa obtida, com posterior precipitação e caracterização química por intermédio de espectrometria de massa. As maiores produtividades de emulsificantes extracelulares foram obtidas com glicerol (0,20 UE.h-1) e óleo de soja (0,21 UE.h-1), em 48 horas de cultivo. Em ensaios posteriores, realizados com aumento da concentração de indutor, foi verificado um aumento das produtividades extracelulares para 0,45 UE.h-1 para o glicerol e 0,30 UE.h-1 para o óleo de soja. A maior redução da tensão superficial foi de 9,89%, em 72 horas, para o indutor óleo diesel. A diminuição dessa tensão, aliada ao aumento das atividades emulsificantes, é um importante indicativo da utilização do substrato hidrofóbico pelo microrganismo. O estudo comprova aumento na produção de biossurfactantes extracelulares quando realizada otimização de cultivo. Para a produção dos intracelulares, a necessidade de processo de rompimento celular aumenta os custos do bioprocesso.

ABSTRACT Biosurfactants implicate many environmental applications, being produced by a wide range of microorganisms. Those from the Saccharomyces cerevisiae yeast are still poorly studied for environmental purposes and are non-toxic. The aim of the study was the production of intra- and extracellular biosurfactants by the Saccharomyces cerevisiae yeast. The yeast was grown in cultured medium containing 0.5% yeast extract, 1% peptone and variable concentrations of sucrose and oily inducers. Inducers used were glycerol, soybean oil and diesel oil. Experiments were conducted for 96 h, and the daily production of biosurfactants was evaluated by reducing surface tension and stabilizing emulsions. Extracellular biosurfactant was extracted from the obtained biomass, with subsequent precipitation and chemical characterization by mass spectrometry. The highest extracellular emulsifier yields were achieved with glycerol inductor (0.20 UE h-1) and soybean oil (0.21 UE h-1) in 48h of cultivation. In later tests performed with increasing concentration of inducer, an increase in extracellular yields was noticed in these experiments (0.45 UE h-1 for glycerol and 0.30 UE h-1 for the soybean oil). The greatest reduction in surface tension was 9.89% in 72 h for diesel oil inducer. The reduction of surface tension combines with the increase of emulsifying activities in an important indicator of the use of hydrophobic substrate by the microorganism. The study confirms an increase in the production of extracellular biosurfactants when optimizing cultivation. The production of intracellular biosurfactants has also been verified, however the process of cellular disruption increases the cost of the bioprocess.

Filamentous fungi producing enzymes under fermentation in cassava liquid waste / Fungos filamentosos produtores de enzimas sob fermentação em manipueira

The conversion of agroindustrial residues by microorganisms has been explored from fermentative processes to obtain several bioactive molecules. The objective of this work was to isolate and select filamentous fungi present in cassava liquid waste for the production of amylase, carboxymethylcellulose (CMCase), pectinase and xylanase using the same residue as induction substrate in fermentative processes. A total of 65 filamentous fungi were isolated and qualitative tests indicated that approximately 86% of these strains were able to produce at least one of the enzymes and 32% capable of producing the four enzymes. Fermentation assays in cassava liquid residue-containing medium showed 6 fungal lines as potential enzyme producers. The maximum activities of pectinase, xylanase, amylase and CMCase were respectively observed at 96 hours of fermentation by the strain by the strain Aspergillus sp. B5C; at 120 hours (163.6 ± 0.13 nKat mL-1), by Aspergillus sp. B4I; at 144 hours (99.8 ± 0.24 nKat mL-1), by Penicillium sp. B3A; and at 48 hours (55.5 ± 0.21 nKat mL-1), by Aspergillus sp. B4O. These results suggest that cassava liquid waste was source of filamentous fungi producing amylase, CMCase, pectinase and xylanase, as well as a promising alternative substrate for bioprocesses aiming the production of enzymes.

A conversão de resíduos agroindustriais por micro-organismos tem sido explorada a partir de processos fermentativos para obtenção de diversas moléculas bioativas. O objetivo deste trabalho foi isolar e selecionar fungos filamentosos presentes em manipueira para produção de amilase, carboximetilcelulase (CMCase), pectinase e xilanase utilizando o próprio resíduo como substrato indutor. Um total de 65 fungos filamentosos foi isolado e testes qualitativos indicaram que, aproximadamente, 86% dessas linhagens foram hábeis em produzir pelo menos uma das enzimas e 32% capazes de produzir as quatro enzimas. Ensaios fermentativos em meio contendo manipueira apontaram 6 linhagens fúngicas como potenciais produtoras de enzimas. As atividades máximas de pectinase, xilanase, amilase e CMCase foram observadas, respectivamente, às 96 horas de fermentação (67.4 ± 0,6 nKat mL-1), pela linhagem Aspergillus sp. B5C; às 120 horas (163.6 ± 0,13 nKat mL-1), por Aspergillus sp. B4I; às 144 horas (99.8 ± 0,24 nKat mL-1), por Penicillium sp. B3A; e às 48 horas (55.5 ± 0,21 nKat mL-1), por Aspergillus sp. B4O. Estes resultados sugerem a manipueira como fonte de fungos filamentosos produtores de amilase, CMCase, pectinase e xilanase, além de um promissor substrato alternativo para bioprocessos visando a produção dessas enzimas.

Produção de proteínas heterólogas em microalga / Production of heterologous protein in microalga

O objetivo desta tese foi explorar o sistema de produção de proteínas heterólogas em microalga com ênfase em Chlamydomonas reinhardtii por meio de: (1) desenvolvimento de um fotobiorreator tubular fechado de escala laboratorial, utilizando técnicas de manufatura digital; (2) avaliação de 7 diferentes proteínas fluorescentes (mTagBFP, Cerulean, Emerald, crGFP, cOFP, tdTomato e mCherry), como sistema reporter de secreção de proteínas em microalga; (3) avaliação do fotobiorreator desenvolvido utilizando cultivo de cepas recombinantes; (4) desenvolvimento de novos peptídeos sinais para secreção de proteínas em C. reinhardtii; (5) avaliação da produção de um biofármaco (hialuronidase) em microalgas, por meio da expressão de duas isoenzimas codificadas pelos genes HYA1 e SPAM1 em C. reinhardtii. O fotobiorreator tubular foi avaliado quanto a sua capacidade de resistir ao processo de esterilização por autoclavação e seu desempenho por meio do cultivo de cepa recombinante secretando mCherry. A fluorescência das proteínas fluorescentes foi medida por leitor de placas de fluorescência e visualizada intracelularmente por microscopia confocal de fluorescência. A atividade de hialuronidase foi determinada através de um ensaio enzimático turbidimétrico. O desenvolvimento do fotobiorreator resultou em um sistema fechado resistente a autoclavação, com capacidade de cultivo de cepas recombinantes de C. reinhardtii. Esse fotobiorreator proporcionou uma produtividade máxima de 10 mg/L.d de mCherry da cepa recombinante em sistema fechado, com velocidade específica de crescimento máxima de 1,27 d-1 para a cepa recombinante testada. Todas as proteínas fluorescentes avaliadas apresentaram capacidade de secreção por C. reinhardtii, com diferentes níveis de interferências em sua medição, permitindo a escolha da mCherry como proteína reporter. Entre os peptídeos sinais avaliados (quatro descritos na literatura - BiP, ARS1, CAH1 e IBP1 - e seis preditos), o peptídeo predito "SP5" foi o que apresentou maior capacidade de secreção, determinado por níveis de fluorescência no sobrenadante. A avaliação dos peptídeos sinais constatou a necessidade de explorar o desenvolvimento de sistemas de expressão (e.g. vetores de expressão) aliados a análises computacionais, como o SignalP 4.0. Por último, os dados desse estudo mostram que C. reinhardtii transformadas com o vetor de expressão foi capaz de produzir as duas isoformas de hialuronidase em sua forma ativa, evidenciando a capacidade desse sistema para a produção de biofármacos. Portanto, nesta tese o sistema de expressão de proteínas heterólogas baseado em microalgas foi explorado, atingindo os objetivos propostos. O fotobiorreator desenvolvido tem a capacidade de esterilização em escala laboratorial (1) e em cultivo com cepa recombinante propiciou elevada produtividade (3). As proteínas vermelhas fluorescentes apresentaram-se como as proteínas com menores interferências para estudos de secreção em C. reinhardtii (2). Além disso, o peptídeo predito SP5 apresentou o melhor desempenho na secreção de proteínas (4) e o vetor de expressão empregado permitiu a identificação de cepas produtoras de biofármaco hialuronidase (5). Portanto, o sistema de produção de proteínas heterólogas por microalgas é um sistema promissor e poderá permitir, utilizando sistemas de secreção, obter proteínas de alto valor comercial a baixos custos, empregando a secreção e técnicas de cultivo como a fermentação extrativa

In this thesis, the heterologous protein production in microalgae with emphasis on Chlamydomonas reinhardtii was explored through: (1) development of a laboratory scale closed tubular photobioreactor using digital manufacturing techniques; (2) evaluation of different fluorescent proteins (mTagBFP, Cerulean, Emerald, crGFP, cOFP, tdTomato and mCherry) as a reporter system for protein secretion in microalgae (3) evaluation of photobioreactor developed using recombinant strains culture; (4) development of new signals peptides for protein secretion in C. reinhardtii (5) expression evaluation of a biopharmaceutical (Hyaluronidase) in microalgae, through the expression of two isoenzymes encoded by the HYA1 and SPAM1 genes in C. reinhardtii. The tubular photobioreactor was evaluated for its ability to resist sterilization process by autoclaving and its performance by culturing recombinant strain secreting mCherry. Fluorescence of fluorescent proteins was measured by fluorescence plate reader and observed intracellularly by confocal fluorescence microscopy. The hyaluronidase activity was determined by a turbidimetric enzymatic assay. The development of the photobioreactor resulted in a closed system resistant to autoclaving, capable of culturing recombinant strains of C. reinhardtii. This recombinant strain achieved a maximum productivity of 10 mg/L.day of mcherry in the closed system, with a maximum growth rate of 1.27 d-1 for the recombinant strain tested. All the fluorescent proteins evaluated had C. reinhardtii secretion capacity, with different interference levels in their measurement, allowing the selection of mCherry as a reporter protein. Among the evaluated peptides (four described in the literature - BiP, ARS1, CAH1 and IBP1 - and six predicted), the predicted peptide "SP5" was the one that presented greater capacity of secretion, determined by levels of fluorescence in the supernatant. The results of this study point out the need to explore the development of biological systems (i.e., expression vectors) allied to computational analysis. Finally, the data from this study showed that C. reinhardtii could produce the two isoforms of hyaluronidase in its active form, evidencing the capacity of this system to produce biopharmaceuticals. Therefore, in this thesis the heterologous protein expression system based on microalgae was explored, reaching the proposed objectives. The developed photobioreator has sterilization capabilityin laboratorial scale (1) and in culture with recombinant strain had high productivity (3). The red fluorescent proteins was found as the most suitable proteins for studies of secretion in C. reinhardtii with lower interference levels(2). In addition, the predicted SP5 peptide showed the best performance in protein secretion (4) and the expression vector employed allowed the identification of strains producing biopharmaceutical hyaluronidase (5). Therefore, the system of heterologous proteins production by microalgae is promising and will allow, using secretion systems, to obtain proteins of high commercial value at low costs, using secretion and cultivation techniques such as extractive fermentation